共聚焦显微镜设备介绍

共聚焦显微镜是由显微镜光学系统、激光光源、扫描器及检测及处理系统4部分组成，采用相干性较好的激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对图象进行处理的一套观察、分析和输出系统。共聚焦显微镜的共聚焦成像能有效抑制焦平面外的杂散光和非测量光进入探测器，实现单一焦层面成像，使分辨率大为提高。

共聚焦显微鏡 (Confocal Microscope).结构由以下部分组成：光源、物镜、扫描组件、探测器和应用软件系统。

光源：共聚焦显微镜的光源通常是激光。激光可以提供高功率、高亮度和高单色性的光源，而且其光斑大小和功率可以调整，从而满足样本需求。常见的激光波长包括405nm、488nm、561nm和640nm。

物镜：共聚焦显微镜的物镜分为扫描物镜和探测物镜两种。扫描物镜是一种高数值孔径的物镜，可以将激光经过的样本分辦成小于0.2微米的亚细胞结构。探测物镜还可以提供更高的数值孔径，使其可以采集更多的荧光信号，提高成像质量。

图1：物镜

扫描组件：共聚焦显微镜的扫描组件主要包括扫描镜、扫描镜驱动器、反射镜和光栅。扫描镜是一个开口的极限高速振镜，驱动器可以使扫描镜快速前后横向移动。反射镜可将激光聚焦到样本上，收集反射的荧光光信号。光栅可以将反射的英光光信号进一步分离出来。

探测器：共聚焦显微镜的探测器分为放大器管 (PMT) 和光电二极管 (PIN) 。PMT可以将荧光光信号转换成电信号，可采集到更广泛的波长范围。而PIN具有较快的响应速度和较低的噪音水平，可以更好地适应高速成像。

应用软件系统：应用软件系统可以根据具体需要设置各种功能，但有一点是共同的，就是将扫描位置坐标与检测器接收的信号一一对应起来，并以图像的方式进行储存与显示。

整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。

共聚焦显微镜利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。

图2：共聚焦原理图

计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面的连续光切图像。

共聚焦显微技术是近十几年迅速发展起来的一项高新研究技术，目前应用领域扩展到细胞学、微生物学、发育生物学、遗传学、神经生物学、生理和病理学等学科的研究工作中，成为现代生物学微观研究的重要工具。

共聚焦技术具有成像清晰、获得三维图像、进行多标记观察、活细胞内动态生理反应的实时观察记录、定性定量分析等优势，可以应用于亚细胞水平中观察离子水平的变化并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系等。与传统显微镜相比共聚焦显微镜可抑制图像的模糊，获得清晰的图像；具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片；增加侧向分辨率；由于点对点扫描去除了杂散光的影响。

图3：共聚焦显微技术

共聚焦显微技术是在荧光显微分析技术的基础上发展起来的，利用荧光显微镜可以对生物样品发出的荧光进行观察和分析，但是荧光显微镜收集到的是样品的整体荧光，来自样品内不同部位的荧光信号相互干扰。难以区分，无法获得准确的定位和定量信息。

共聚焦显微技术的出现很好地解决了这一问题，这一技术可以获取细胞内某个薄层面上的荧光信息，而该层以外的信号被消除掉，成像清晰程度大大提高；结合计算机自动控制，可以对荧光信号的分布、强度和动态变化进行全方位的分析，得到丰富的信息。

目前共聚焦的实现有两种方式：激光共聚焦和数字共聚焦。

这种共聚焦技术利用激光作为激发光源，将激光聚焦于样品中的某一点，这样只有该点附近的区域有荧光，其他没有被激发的部位没有荧光，这一区域发出的荧光反射到光电倍增管，在光电倍增管前设有一 个计算机控制的可调节针孔， 保证只有被激发点发出的荧光才能到达光电管，而附近其他点所发出的荧光被挡在视野之外。采用计算机控制激光和针孔，对细胞内的某一层面进行扫描，可以获得清晰的二维图像。

这一技术成像速度快、自动化程度高。但激光具有单色性，一种激光器只能发出某几个特定波长的激光，而荧光染料的种类很多，其激发光波长各不相同，这样在使用某种型号的激光器时，只有少数几种荧光染料可以使用， 而其他大多数的染料不能使用；目前同时配备数个不同激光器或多光子脉冲激光器的激光共聚焦系统的出现，虽然可以解决这一难题，但是设备结构复杂、价格昂贵，维护保养要求较高。

这一技术是随着计算机软件技术的发展出现的，与激光共聚焦的原理有极大的区别， 它在普通的荧光显微镜上加上一个计算机控制的高分辨率、带有制冷装置(以提高信噪比) 的CCD 摄像机， 摄像机获取的图像由计算机进行解卷积(deconvolution) 计算， 这种数字式图像处理可以将聚焦平面以外的图形信号删除， 保留高清晰度的焦平面信息。

这一系统硬件配备比较简单，价格远远低于激光共聚焦系统；由于使用可以发出连续光谱的高压汞灯或氙灯作为光源，使这一技术几乎可以用于所有的荧光染料，应用范围广泛， 其机械部分组成简单，灵活性高。这一技术的不足在于其图像获取、计算对计算机的依赖性高，图象获取时间相对较长，实验时除要分析的层面被激发外，细胞内其他部位也被激发， 增加了荧光染料的光淬灭，对某些容易被光淬灭的染料会造成明显的影响；随着计算机和摄像技术的发展，这些问题也在逐步解决。